CTAB(Cetyltrimethylammonium Bromide,十六烷基三甲基溴化铵)法是植物基因组DNA提取的经典方法之一,该方法特别适用于含大量多糖和多酚的植物组织。CTAB是一种阳离子去污剂,其作用原理基于离子强度的调控:在低离子强度条件下,CTAB可以从溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖;而在高离子强度条件下(NaCl浓度大于0.7 M),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物而不沉淀核酸,从而实现核酸的选择性保留。在核酸分离过程中,通过有机溶剂(氯仿/异戊醇或酚/氯仿)抽提去除蛋白、多糖、酚类等杂质后,加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。
实验步骤如下:首先进行材料研磨,取0.2-0.5克新鲜植物组织于液氮中研磨成粉末,若进行RNA提取需特别注意使用RNase-free条件。接着进行样品裂解,按照每100 mg研磨粉末使用0.5 ml提取缓冲液的比例转入离心管中,立即加入65℃预热的2×CTAB提取缓冲液,65℃水浴30分钟并间歇混匀,部分研究采用60-65℃加热30-60分钟。然后进行有机溶剂抽提,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)颠倒充分混匀几分钟,12,000 rpm离心5分钟,若样品富含多糖多酚可先用酚/氯仿(1:1)抽提。随后进行核酸沉淀,取上层水相加入等体积异丙醇沉淀DNA,高速离心10-15分钟,改进方案显示优化沉淀温度和沉淀时间可提高DNA产量。最后进行洗涤与溶解,用75%乙醇漂洗一次弃上清,微干燥后加入适量TE缓冲液溶解DNA,部分改进方法省略液氮步骤以降低成本和危害性。
在CTAB法的改良方面,多项研究提出了简化版方法。其中免液氮的改进方法是一个重要发展方向,这种方法不仅降低了实验成本和危险性,同时还能保持较好的DNA提取效果,为实验室常规操作提供了更便捷的方案。
针对不同类型样本,CTAB法也进行了针对性优化。对于水生植物,采用高浓度CTAB和高摩尔盐去除多糖是常见策略;对于多年生植物,则需要增加β-巯基乙醇用量、简化抽提步骤,并使用预冷异丙醇沉淀以提高效果;而对于中药材花瓣等特殊组织,则需添加PVP(聚乙烯吡咯烷酮)并增加抽提次数以有效去除多酚类杂质。
在高通量与自动化方向上,近年来的研究尝试将CTAB法与商业试剂盒相结合,旨在提高效率并减少操作时间。这种结合方法既保留了CTAB法对复杂植物组织的良好提取能力,又吸收了商业试剂盒的操作便利性,为大规模样本分析提供了可能。
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